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多肽及其在制備抗神經退行性疾病藥物方面的應用的制作方法

文檔序號:26534909發布日期:2021-09-04 16:51
多肽及其在制備抗神經退行性疾病藥物方面的應用的制作方法

1.本發明涉及多肽及其在制備抗神經退行性疾病藥物方面的應用,該系列多肽為dvl
?
2的特定多肽片段,屬于生物醫藥技術領域。


背景技術:

2.神經退行性疾病(如阿爾茨海默病,帕金森病等)以特異性神經元丟失為主要特征,是一類進行性發展的疾病。包括阿爾茨海默癥、帕金森病等在內的神經退行性疾病大多發生機理復雜,具體病因尚無定論,缺乏有效治愈手段。亟需研究和開發能有效防治神經退行性疾病的方法及藥物。
3.帕金森病是最常見的神經退行性疾病之一,多發于老年人群體。帕金森病最主要的病理改變包括中腦黑質多巴胺能神經元異常退化,及其導致的紋狀體多巴胺顯著減少和路易小體的形成,臨床表現為靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢步態異常等運動障礙,甚至出現認知障礙等非運動癥狀。中國帕金森病患者在全球帕金森病高發國家中約占一半,且隨著人口老齡化不斷加速,帕金森病導致的社會負擔也日益加劇。
4.阿爾茨海默病是最常見的神經退行性疾病,主要臨床表現為認知功能和學習障礙、記憶力衰退等。隨著人口老齡化不斷加速,近年阿爾茨海默病患病人數正在急劇增加,其導致的社會負擔也日益加劇,尤其在中國,阿爾茨海默病患者人數已居世界第一,防治阿爾茨海默病藥物市場需求巨大。
5.dishevelled(dvl)是經典wnt信號通路中的重要調控因子。哺乳動物體內dvl主要包括dvl
?
1、dvl
?
2和dvl
?
3,它們均包含高度保守的dix、pdz和dep三個基本結構域。本發明的發明人經過大量探索、實驗及研究工作,目前已取得與dvl
?
2有關的研究成果。


技術實現要素:

6.本發明的主要目的是:根據發明人新近研究成果,針對現有技術存在的問題,提出一種多肽,能應用于制備抗神經退行性疾病藥物。同時,還提供該多肽的用途。
7.本發明解決其技術問題的技術方案如下:
8.一種多肽,其特征是,所述多肽的氨基酸序列為seq id no:1至seq id no:14之一。
9.優選地,所述多肽的氨基酸序列為seq id no:2、seq id no:5、seq id no:7、seq id no:8之一。
10.該系列多肽是dvl
?
2蛋白的特定多肽片段,能應用于制備抗神經退行性疾病藥物。
11.一種多肽,其特征是,由前文所述多肽與細胞穿透肽連接而成,所述細胞穿透肽位于多肽的n端;所述細胞穿透肽的氨基酸序列為seq id no:15至seq id no:47之一。
12.一種多肽,其特征是,由前文所述多肽經連接肽與細胞穿透肽連接而成,所述連接肽、細胞穿透肽均位于多肽的n端;所述細胞穿透肽的氨基酸序列為seq id no:15至seq id no:47之一,所述連接肽的氨基酸序列為seq id no:48至seq id no:72之一。
13.前文所述多肽用于制備治療或預防神經退行性疾病的藥物的用途。
14.其中,所述神經退行性疾病包括阿爾茨海默病或帕金森病。
15.本發明還提出:
16.編碼前文所述多肽的核酸。
17.含有前文所述多肽或前文所述核酸的藥物組合物。
18.前文所述藥物組合物用于制備治療或預防神經退行性疾病的藥物制劑的用途。
19.本發明的發明人經過大量探索、實驗及研究工作,基于dvl
?
2進行構效關系分析,設計若干多肽序列并進行活性檢測,最終獲得具有防治神經退行性疾病的生物學活性的系列多肽。本發明所涉及的系列多肽能治療或預防神經退行性疾病,具有良好的應用前景。
附圖說明
20.圖1為本發明實施例1的結果示意圖,a圖和b圖的縱坐標均為相對細胞存活率。a圖中,control組為對照組,rotenone組為模型組,rotenone+peptide(2,5,7,8)組為待測多肽組(待測多肽分別為多肽seq id no:2,多肽seq id no:5,多肽seq id no:7,多肽seq id no:8)。b圖中,control組為對照組,rotenone組為模型組,其余實驗組為待測多肽組,rotenone+tat組中待測多肽為細胞穿透肽seq id no:15,rotenone+tat
?
peptide(2,5,7,8)組中待測多肽分別為含有多肽seq id no:2、多肽seq id no:5、多肽seq id no:7或多肽seq id no:8的第二組多肽。
21.圖2為本發明實施例2的結果示意圖,hoechst標記細胞核,呈現藍色;pi標記凋亡或壞死細胞,呈現紅色。圖中,control組為對照組,rotenone組為模型組,rotenone+peptide 2組為待測多肽組(待測多肽為多肽seq id no:2)。
22.圖3為本發明實施例3的結果示意圖。圖中,rotenone(
?
)peptide 2(
?
)組為對照組,rotenone(+)peptide 2(
?
)組為模型組,rotenone(+)peptide2(+)組為待測多肽組(待測多肽為多肽seq id no:2)。
23.圖4為本發明實施例4的結果示意圖,縱坐標為相對細胞存活率,control組為對照組,aβ
25
?
35
組為模型組,aβ
25
?
35
+peptide(2,5,7,8)組為待測多肽組(待測多肽分別為多肽seq id no:2,多肽seq id no:5,多肽seq id no:7,多肽seq id no:8)。
24.圖5為本發明實施例5的結果示意圖,hoechst標記細胞核,呈現藍色;pi標記凋亡或壞死細胞,呈現紅色。圖中,control組為對照組,aβ
25
?
35
組為模型組,aβ
25
?
35
+peptide 2組為待測多肽組(待測多肽為多肽seq id no:2)。
25.圖6為本發明實施例6的結果示意圖。圖中,control組為對照組,mptp組為模型組,其余實驗組為待測多肽組,mptp+tat組中待測多肽為細胞穿透肽seq id no:15,mptp+tat
?
peptide(2,5,7,8)組中待測多肽分別為含有多肽seq id no:2、多肽seq id no:5、多肽seq id no:7或多肽seq id no:8的4條多肽。
26.圖7為本發明實施例7的結果示意圖。其中,a圖為各組實驗小鼠黑質中th表達量的檢測,b圖為各組實驗小鼠紋狀體中th表達量的檢測。圖中,con組為對照組,mptp
?
non組為模型組,其余實驗組為待測多肽組,mptp+tat組中待測多肽為細胞穿透肽seq id no:15,mptp+tat
?
peptide(2,5,7,8)組中待測多肽分別為含有多肽seq id no:2、多肽seq id no:5、多肽seq id no:7或多肽seq id no:8的4條多肽。
具體實施方式
27.下面參照附圖并結合實施例對本發明作進一步詳細描述。但是本發明不限于所給出的例子。
28.實施例1
29.本實施例為檢測各多肽對帕金森病樣模型神經細胞死亡的影響。
30.本實施例的待測多肽如下:
31.(1)第一組多肽:多肽seq id no:2,多肽seq id no:5,多肽seq id no:7,多肽seq id no:8。
32.(2)第二組多肽:

多肽seq id no:2+連接肽seq id no:48+細胞穿透肽seq id no:15;

多肽seq id no:5+連接肽seq id no:48+細胞穿透肽seq id no:15;

多肽seq id no:7+連接肽seq id no:57+細胞穿透肽seq id no:15;

多肽seq id no:8+連接肽seq id no:48+細胞穿透肽seq id no:15。注:細胞穿透肽seq id no:15即細胞穿透肽tat。
33.本實施例的具體實驗過程如下:
34.待測多肽組:sh
?
sy5y細胞經過10μm維甲酸誘導分化6天后,選擇處于對數生長期的分化后sh
?
sy5y細胞,以3
×
104個/ml的密度接種于96孔板(每孔100μl),在37℃、5%co2細胞培養箱中培養。培養24h后加入rotenone(0.1μm)(注:rotenone即魚藤酮),并加入待測多肽(40μm),設6個復孔。培養24h后,每孔加入10%培養基體積的5mg/ml mtt溶液,于37℃恒溫細胞培養箱內孵育4h,棄去上清液,每孔內加入150μl dmso后在酶標板振蕩器上500r/min振蕩10min,使藍紫色結晶甲臜完全溶解。振蕩結束后置酶標儀中以570nm為檢測波長,630nm為參比波長,測定各孔的od值,并計算細胞存活情況。
35.與上述待測多肽組相比,對照組不加rotenone和待測多肽,模型組不加待測多肽。
36.結果如圖1所示,與模型組相比,第一組多肽以及第二組多肽均能緩解帕金森病樣模型神經細胞死亡,而單獨細胞穿透肽tat則未顯示出顯著細胞保護作用。
37.實施例2
38.本實施例為檢測多肽對帕金森病樣模型神經細胞凋亡的影響。
39.本實施例的待測多肽為多肽seq id no:2。
40.本實施例的具體實驗過程如下:
41.待測多肽組:sh
?
sy5y細胞經過10μm維甲酸誘導分化6天后,選擇處于對數生長期的分化后sh
?
sy5y細胞,以5
×
104個/ml的密度接種于6孔板(每孔1000μl),在37℃、5%co2細胞培養箱中培養。培養24h后加入rotenone(0.1μm),并加入待測多肽(40μm),設3個復孔。培養24h后,棄去6孔板中培養基,使用pbs緩沖液洗滌細胞3次,每次3min;每孔加入1000μl含有hoechst 33342(7mm)的培養基于37℃培養箱中孵育25min。pbs緩沖液洗滌細胞2次,每孔加入1000μl含有pi(2mm)的培養基,室溫下避光孵育15min。染色完成后,使用pbs緩沖液洗滌細胞3次,洗滌完成后在倒置熒光顯微鏡下進行觀察拍照。
42.與上述待測多肽組相比,對照組不加rotenone和待測多肽,模型組不加待測多肽。
43.結果如圖2所示,hoechst標記細胞核,呈現藍色;pi標記凋亡或壞死細胞,呈現紅色。與模型組相比,多肽seq id no:2可有效減少帕金森病樣模型神經細胞凋亡。
44.實施例3
45.本實施例為檢測多肽對帕金森病樣模型神經細胞病理異常的影響。
46.本實施例的待測多肽為多肽seq id no:2。
47.本實施例的具體實驗過程如下:
48.待測多肽組:sh
?
sy5y細胞經過10μm維甲酸誘導分化6天后,選擇處于對數生長期的分化后sh
?
sy5y細胞,以5
×
104個/ml的密度接種于6孔板(每孔1000μl),在37℃、5%co2細胞培養箱中培養。培養24h后加入rotenone(0.1μm),并加入待測多肽(40μm),設3個復孔。培養24h后提取細胞蛋白并制樣,具體過程如下:棄去6孔板中培養基,使用pbs緩沖液洗滌細胞3次,收集孔中細胞于ep管內,加入300μl ripa裂解液(按1:100的比例加入蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑混合液),冰上裂解30min。4℃12000r/min離心20min,收集上清,使用bca蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度并使用pbs緩沖液將蛋白濃度調節至同一水平,向蛋白溶液中加入1/4總體積的5
×
sds上樣緩沖液,充分混勻后置于沸水中加熱10min,于
?
20℃冰箱中保存。蛋白樣品通過蛋白質免疫印跡法進行分析,具體過程如下:配制sds
?
page凝膠,置于電泳槽后,加入電泳緩沖液,將蛋白樣品加入上樣孔,進行恒壓電泳。溴酚藍條帶遷移至膠板底部時停止電泳,使用半干轉膜儀將目的蛋白條帶轉移至pvdf膜上,3%脫脂奶粉封閉2h,采用抗th抗體于4℃孵育過夜,并使用相對應的辣根過氧化物酶偶聯的二抗孵育,最后使用化學發光試劑進行條帶曝光。
49.與上述待測多肽組相比,對照組不加rotenone和待測多肽,模型組不加待測多肽。
50.結果如圖3所示,與模型組相比,多肽seq id no:2能增加帕金森病樣模型神經細胞的th表達水平,減輕帕金森病樣模型神經細胞病理異常。
51.實施例4
52.本實施例為檢測各多肽對阿爾茨海默病樣模型神經細胞死亡的影響。
53.本實施例的待測多肽為4條多肽:多肽seq id no:2,多肽seq id no:5,多肽seq id no:7,多肽seq id no:8。
54.本實施例的具體實驗過程如下:
55.待測多肽組:選擇處于對數生長期sh
?
sy5y細胞,以3
×
104個/ml的密度接種于96孔板(每孔100μl),在37℃、5%co2細胞培養箱中培養。培養24h后加入aβ
25
?
35
(0.05μm)(注:aβ
25
?
35
即β
?
淀粉樣蛋白片段),并加入待測多肽(40μm),設6個復孔。培養24h后,每孔加入10%培養基體積的5mg/ml mtt溶液,于37℃恒溫細胞培養箱內孵育4h,棄去上清液,每孔內加入150μl dmso后在酶標板振蕩器上500r/min振蕩10min,使藍紫色結晶甲臜完全溶解。振蕩結束后置酶標儀中以570nm為檢測波長,630nm為參比波長,測定各孔的od值,并計算細胞存活情況。
56.與上述待測多肽組相比,對照組不加aβ
25
?
35
和待測多肽,模型組不加待測多肽。
57.結果如圖4所示,與模型組相比,4條多肽均能緩解阿爾茨海默病樣模型神經細胞死亡。
58.實施例5
59.本實施例為檢測多肽對阿爾茨海默病樣模型神經細胞凋亡的影響。
60.本實施例的待測多肽為多肽seq id no:2。
61.本實施例的具體實驗過程如下:
62.待測多肽組:選擇處于對數生長期的sh
?
sy5y細胞,以5
×
104個/ml的密度接種于6孔板(每孔1000μl),在37℃、5%co2細胞培養箱中培養。培養24h后加入aβ
25
?
35
(0.05μm),并
加入待測多肽(40μm),設3個復孔。培養24h后,棄去6孔板中培養基,使用pbs緩沖液洗滌細胞3次,每次3min;每孔加入1000μl含有hoechst 33342(7mm)的培養基于37℃培養箱中孵育25min。pbs緩沖液洗滌細胞2次,每孔加入1000μl含有pi(2mm)的培養基,室溫下避光孵育15min。染色完成后,使用pbs緩沖液洗滌細胞3次,洗滌完成后在倒置熒光顯微鏡下進行觀察拍照。
63.與上述待測多肽組相比,對照組不加aβ
25
?
35
和待測多肽,模型組不加待測多肽。
64.結果如圖5所示,hoechst標記細胞核,呈現藍色;pi標記凋亡或壞死細胞,呈現紅色。與模型組相比,多肽seq id no:2可有效減少阿爾茨海默病樣模型神經細胞凋亡。
65.實施例6
66.本實施例為檢測各多肽對模型小鼠帕金森病樣行為異常的影響。
67.本實施例的待測多肽為4條多肽:

多肽seq id no:2+連接肽seq id no:48+細胞穿透肽seq id no:15;

多肽seq id no:5+連接肽seq id no:48+細胞穿透肽seq id no:15;

多肽seq id no:7+連接肽seq id no:57+細胞穿透肽seq id no:15;

多肽seq id no:8+連接肽seq id no:48+細胞穿透肽seq id no:15。
68.本實施例的具體實驗過程如下:
69.取8周齡雄性c57bl/6小鼠飼養于溫度22℃~24℃、濕度50%、每日光照時間12h的飼養室中,小鼠可自由獲得食物和水。實驗小鼠隨機分為7組:control組,mptp組,mptp+tat組,mptp+tat
?
peptide 2組,mptp+tat
?
peptide5組,mptp+tat
?
peptide 7組,mptp+tat
?
peptide 8組。第1~6天腹腔注射待測多肽溶液(1μg/g,每日1次),在第2天腹腔注射mptp(20mg/kg;間隔2h,共4次),對照組注射等量的生理鹽水。第8天進行曠場實驗,行為學實驗結束后處死小鼠,進行腦組織采集。
70.曠場實驗裝置由曠場反應箱和數據自動收集處理系統兩部分組成,小鼠曠場反應箱底部邊長50cm,反應箱高度為35cm,內壁涂為淺色調,并用隔板分隔為全等的四個小方格,正上方1~2米處架設一攝像頭,其視野可覆蓋整個曠場內部。實驗在安靜的環境下進行。首先打開曠場實驗配套軟件,按實驗要求將參數設置完成后,將小鼠輕柔地放于反應箱底面中心,同時進行攝像和數據的收集。小鼠在反應箱中自由探索環境5min,觀察并記錄5min內小鼠在曠場中的活動情況。
71.結果如圖6所示,與模型組小鼠相比,4條多肽均能提高帕金森病模型小鼠的自主活動能力和空間探索能力,減輕模型小鼠帕金森病樣行為異常,而單獨細胞穿透肽tat則未顯示出顯著改善作用。
72.實施例7
73.本實施例為檢測各多肽對帕金森病模型小鼠腦黑質、紋狀體組織病理異常的影響。
74.本實施例的待測多肽為4條多肽:

多肽seq id no:2+連接肽seq id no:48+細胞穿透肽seq id no:15;

多肽seq id no:5+連接肽seq id no:48+細胞穿透肽seq id no:15;

多肽seq id no:7+連接肽seq id no:57+細胞穿透肽seq id no:15;

多肽seq id no:8+連接肽seq id no:48+細胞穿透肽seq id no:15。
75.本實施例的具體實驗過程如下:
76.小鼠飼養以及處理方式同實施例6。處死小鼠后,冰上分離小鼠腦黑質和紋狀體,
并放置于已稱重的ep管中,按照10μl/mg加入ripa組織裂解液(按1:100的比例加入蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑混合液)。使用組織勻漿器于冰上進行勻漿,并置于渦旋儀上充分振蕩裂解,每5min一次,共5次,之后采用高速冷凍離心機于4℃,12000r/min離心10min后取上清液。使用bca蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度并使用pbs緩沖液將蛋白濃度調節至同一水平,向蛋白溶液中加入1/4總體積的5
×
sds上樣緩沖液,充分混勻后置于沸水中加熱10min,于
?
20℃冰箱中保存。蛋白樣品通過蛋白質免疫印跡法進行分析,方法同實施例3。
77.結果如圖7所示,與模型組小鼠相比,4條多肽均能提高帕金森病模型小鼠黑質和紋狀體中th的表達量,減輕模型小鼠帕金森病樣病理異常,而單獨細胞穿透肽tat則未顯示出顯著改善作用。
78.在本發明中,多肽還可以是下表中除seq id no:2、seq id no:5、seq id no:7、seq id no:8外的其它序列。
[0079][0080][0081]
細胞穿透肽還可以是下表中除seq id no:15外的其它序列。
[0082]
seq id no序列15ygrkkrrqrrr16grkkrrqrrr17grkkrrqrrrppq18cygrkkrrqrrr19rkkrrqrrr20rrrqrrkkrgy21rrrr22rrrrrr23rrrrrrr24rrrrrrrr25rrrrrrrrr26rrrrrrrrrr
27rrrrrrrrrrrr28rrrrrrrrrrrrrrr29rqikiwfqnrrmkwkk30yaraaarqara31lstaadmqgvvtdgmasgldkdylkpdd32ketwwetwwtewsqpkkrkv33cvkrglklrhvrprvtrmdv34daatatrgrsaasrpterpraparsasrprrpvd35rggrlsysrrrfststgr36rrirprpprlprprprplpfprpg37pievcmyrep38vptlk39chhhhhrrrrrrrrrhhhhhc40mvtvlfrrlrirracgpprvrv41ac
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[0083]
連接肽還可以是除seq id no:48、seq id no:57外的其它序列。
[0084]
[0085][0086]
除上述實施例外,本發明還可以有其他實施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術方案,均落在本發明要求的保護范圍。
再多了解一些
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